利用玉米醇溶蛋白测试法测定表面活性剂的刺激性（上）

作者简介

毛勇进

本会首批资深工程师，中国科学院生物物理研究所生物化学与分子生物学博士，广州市诗泊苓化妆品有限责任公司创始人，广州市科聚化妆品创新研发中心联合创始人，广东省化妆品学会理事兼配方专业委员会副主任委员。曾获得科技成果2项，同时获得广东省轻工业协会科学技术进步奖二等奖、三等奖；发表日化研究方面文章6篇；获得2项发明专利、1项实用新型专利授权， 5项发明专利已被授理；参与1项国标制定。

 

利用玉米醇溶蛋白测试法测定表面活性剂的刺激性

毛勇进

广州市诗泊苓化妆品有限责任公司

摘要：在测试表面活性剂刺激性的离体方法中，玉米醇溶蛋白法是相对快捷的方法。对玉米醇溶蛋白法原理、相关性、过程、应用范围、优缺点做了详细的论述。讨论了影响玉米醇溶蛋白法的可能因素，提出了可能的研发方向。

关键词：表面活性剂；玉米醇溶蛋白法；凯氏定氮法；刺激性

一、为什么能用玉米醇溶蛋白测试法测定表面活性剂的刺激性

表面活性剂对人体皮肤、眼睛、毛发,特别是对皮肤、眼睛的温和性是一个颇难定义的概念,截止目前为止仍然没有统一的标准。表面活性剂对粘膜产生的刺激性或致敏性主要由三个因素引起^[1]:

1溶出性

指表面活性剂对皮肤本身的保湿成分(如保湿因子NMF)、细胞间脂质及角质层中游离氨基酸和脂肪的溶出程度。这些成分的过分溶出将使皮肤油脂和表层受到破坏,皮肤保水能力下降,引起细胞成皮屑脱落,从而造成皮肤紧绷、刺痛或干燥感。更有甚者,表面活性剂除了对细胞有剥离作用外,还对细胞有溶解作用,如SDS就是生物膜的很有效的溶解剂。

2渗入性

指表面活性剂经皮渗透的能力,这种作用被认为是引发皮肤各种炎症的原因之一。表面活性剂渗入改变了皮肤的原始结构状态和相邻分子间的相容性,从而引发接触性皮炎、真皮皮炎,造成皮肤刺激作用甚至引起过敏反应,使皮肤上出现红斑和水肿现象。表面活性剂对皮肤粘膜的刺激作用以阳离子最甚,阴离子次之,非离子型和两性离子型最小。

3反应性

指表面活性剂对蛋白质的吸附,致使蛋白质变性以及改变皮肤pH条件等的作用。实验表明PEG非离子类的反应性较低,LAS等阴离子的反应性较大。

 

目前，国内测试表面活性剂的刺激性，多采用动物眼刺激试验和动物皮肤刺激试验。随着动物保护主义的兴起，3R原则（减少、优化、替代）已经越来越被各国政府接受。自2013年3月11日起，欧盟禁止用动物对化妆品的安全性进行测试，禁止销售任何用动物进行测试的化妆品包括化妆品成分。其它国家也在陆续跟进，各种动物替代实验被发展出来。

表面活性剂刺激性离体测试法，是利用表面活性剂作用于类似人体组织的体外细胞或蛋白模拟生物体，并用一定方法表征其作用程度，进而间接地表征对活体组织的作用程度。文献报道的离体测试方法已有多种，如：角质层吸附法、牛蛋白质反应法、考马斯亮兰法^[2]、鸡胚绒毛尿囊膜试验法^[3]、RBC test(红血球细胞试验法)和Zein test（玉米醇溶蛋白测试法）^[1]。

Zein test是离体测试方法中相对快捷的方法^[4]，早在 20 世纪 60 年代，Gotte和Schwinger就提出利用玉米醇溶蛋白（以下简称 Zein）测试表面活性剂的刺激性，Zein在表面活性剂溶液中的溶解度与刺激性有很好的相关性^[5,6]。卡斯特纳和福罗斯奇的一个很重要的工作是把实验室试验结果与动物试验结果关联起来。纵观这些方法,两个系列有很好的相关性。已经检验了动物试验和实验室试验的对皮肤的相容性。Zein test结果最相近于人类皮肤的相容性(相关系数0.79)^[4]。

国内学者从20世纪90年代末开始，利用Zein test对表面活性剂以及洗发沐浴产品进行了测试。董银卯等测得：1、月桂醇硫酸酯盐，钠盐>单乙醇胺盐>铵盐>三乙醇胺盐>镁盐。从钠盐到三乙醇胺盐的刺激性强弱,与文献^[1]所列顺序完全相吻合。2、月桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐：桂醇聚氧乙烯醚硫酸酯盐的zein值普遍比相应的月桂醇硫酸酯盐小,它们均属于低刺激性和无刺激性范畴。在醇醚硫酸酯盐类中,增加氧乙烯的量则刺激性就降低,如月桂醇聚氧乙烯(2)醚钠盐的zein值比月桂醇聚氧乙烯(3)醚硫酸酯钠盐大,亦即后者的刺激性小于前者,这也是符合一般规律的。至于氧乙烯数相同的月桂醇聚氧乙烯(3)醚硫酸酯盐,其zein值大小或刺激性大小顺序是钠盐>铵盐>三乙醇胺盐>镁盐。3、不同碳链的烷基硫酸酯盐:同样是镁盐,随着碳链即疏水基链的增长,表面活性剂刺激性随之降低,对人体也就越温和。这类镁盐基本上为低刺激性表面活性剂^[7]。欧泽亮等测得成人用洗发香波A,B,C,D,F 刺激性大体相当，洗发香波E刺激性较高；而儿童用洗发沐浴2合1香波G的刺激性明显低于成人用洗发香波，这跟该儿童香波厂商宣传其低刺激、更温和是一致的^[8]。张鹏等测得测定了阴离子、阳离子、非离子、两性离子４类表面活性剂的刺激性，发现刺激性的强弱顺序为：阳离子＞阴离子＞两性离子＞非离子；而在阴离子表面活性剂中，钠盐刺激性高于铵盐。测试结果和变化趋势与文献报道^［1,9］相吻合^[10]。从上述实验数据可以看到，利用Zein test对表面活性剂以及洗发沐浴产品进行了测试，得到的结论是可靠的，与其它文献的报道相关性很强。

二、原理

Zein具有独特的氨基酸组成，其分子中不仅存在大量的疏水性氨基酸，同时还含有较多的含硫氨基酸，但缺乏能带电的酸性、碱性和极性基团氨基酸，因此Zein具有独特的溶解性，几乎不溶于水。Namita Deo等提出Zein在与月桂醇硫酸酯钠（SDS）作用后在水中的溶解性变化的模型^[11] ，从分子结构变化的角度诠释了Zein与表面活性剂作用后随着结构变化产生的水溶性变化，如图 1。

图 1 表面活性剂SDS引起 Zein 的结构变化模型

基于只有Zein变性后才溶于水，Gotte等提出了用其测试表面活性剂的的刺激性。将Zein添加到含1％活性物的表面活性剂水溶液体系中，Zein溶解于表面活性剂溶液中，因Zein有较高的含氮量而使溶液中的含氮量增加，利用 Zein 溶解前后体系中氮含量之差（即Zein值），表征 Zein 在体系中溶解度的大小，进而表征体系刺激性的强弱，Zein 值越大，表明溶解的 Zein 越多，表面活性剂体系的刺激性越大^[8]。

zein值=A-B, zein值用溶液中所含氮的N g/L数表示, N g/L。通过zein值,可把表面活性剂的刺激性分为3类:

(1)zein值大于N 4g/L溶液的表面活性剂为“强刺激性”,此类表面活性剂对zein增溶的能力比较强。

(2)zein值在N 2g/L～4g/L溶液的表面活性剂为“低刺激性”。

(3)zein值小于N 2g/L溶液的表面活性剂为“无刺激性”,此类表面活性剂促使zein溶解的作用微弱^[7]。

三、玉米醇溶蛋白介绍

玉米中蛋白含量约占干重的６-12％，主要位于玉米胚乳组织中。根据蛋白溶解能力，将玉米中的蛋白分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白四大类^[12]。玉米醇溶蛋白属于醇溶蛋白类，是由Gorhamin在1821年从玉米中提取的一种能溶解于乙醇的蛋白质，并将这种蛋白质取名为玉米醇溶蛋白(zein),简称醇溶蛋白，从此受到科研界的广泛关注^[13]。

根据溶解度、分子量大小以及免疫学反应的不同，Esen A^[14,15]等把zein分为４类：α、β、δ和γzein，其中αzein占总蛋白的75-85%,溶于60-95%醇类溶液中，相对于αzein，βzein不够稳定，易沉淀和聚集，占总蛋白的10-15%，溶于含有还原剂的30-95%异丙醇溶液。δ和γzein含量较小，仅占总蛋白的5-10%，溶于30％异丙醇／30mM醋酸溶液液以及有还原剂0-80%的异丙醇溶液^[16]。因此商业生产的玉米醇溶蛋白基本是由αzein构成。Hamaker等^[17]根据分子量的不同又将αzein分为Z19和Z20蛋白，其分子量分别为22kDa和25kDa。

zein由于含有高比例的非极性氨基酸，缺乏碱性、酸性氨基酸使其具有独特的溶解性，具有疏水性和水不溶性，它不溶于较低浓度的盐溶液，但可溶于醇溶液、高浓度的尿素溶液、高浓度的碱溶液（pH＞11）、阴离子洗涤剂等，在 60-95% 的乙醇溶液中可以维持其分子构象^[18]。玉米醇溶蛋白的疏水性主要是由于肽的作用，低分子量肽的疏水性较弱且含有的非极性氨基酸较少。玉米醇溶蛋白在溶液中含有大量由肽主链上的羟基与亚氨基的氢键作用而形成α–螺旋体，因此具有较强的疏水性^[19]。

四、凯氏定氮法介绍

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。

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参考文献：

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[2]Anav.AS,郦伟章.用体外法测阴离子表面活性剂的刺激性[J].四川日化，1990 （4）：46-49.

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