利用玉米醇溶蛋白测试法测定表面活性剂的刺激性（下）
作者简介
毛勇进
本会首批资深工程师，中国科学院生物物理研究所生物化学与分子生物学博士，广州市诗泊苓化妆品有限责任公司创始人，广州市科聚化妆品创新研发中心联合创始人，广东省化妆品学会理事兼配方专业委员会副主任委员。曾获得科技成果2项，同时获得广东省轻工业协会科学技术进步奖二等奖、三等奖；发表日化研究方面文章6篇；获得2项发明专利、1项实用新型专利授权， 5项发明专利已被授理；参与1项国标制定。
利用玉米醇溶蛋白测试法测定表面活性剂的刺激性
毛勇进
广州市诗泊苓化妆品有限责任公司
摘要：在测试表面活性剂刺激性的离体方法中，玉米醇溶蛋白法是相对快捷的方法。对玉米醇溶蛋白法原理、相关性、过程、应用范围、优缺点做了详细的论述。讨论了影响玉米醇溶蛋白法的可能因素，提出了可能的研发方向。
关键词：表面活性剂；玉米醇溶蛋白法；凯氏定氮法；刺激性
五、实验过程介绍[8,10]
１、样品前处理
配制活性成分质量分数为1％的表面活性剂水溶液，取30ml，加入g过量的Zein，25℃搅拌120分钟，过滤，滤液备用待消化。以不加Zein、质量分数1％的表面活性剂水溶液为空白对照。
2、样品消化
移取5ml添加zein的滤液至凯氏定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、 2.5g硫酸钾及10ml浓硫酸，放在消化炉中消化60分钟后呈浅蓝色澄清透明状，即为消化液，以不加zein的溶液为空白对照。消化过程中的升温程序见表1。
表1：消化升温程序
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初始温度（℃） |
保持时间（min) |
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100 |
5 |
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200 |
5 |
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250 |
5 |
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300 |
5 |
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400 |
10 |
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440 |
30 |
3、碱化蒸馏
碱化蒸馏过程在凯氏定氮仪中进行，向消化液中加入足量的质量分数为40％ 的NaOH溶液进行碱化然后蒸馏5分钟，将碱化过程中产生的NH3气体导入装30ml质量分数为４％的硼酸溶液的锥形瓶中，蒸馏结束后，取下锥形瓶时用去离子水清洗导管。
4、样品滴定
用 Na2CO3作为基准物质标定0,02mol/L盐酸，用标定好的盐酸滴定样品，加10滴0.1%溴甲酚绿-0.2%甲基红(5:1体积比）混合溶液到锥形瓶中作为指示剂。溶液由蓝色变为浅红色即为滴定终点，记录盐酸读数，按照式（1）计算样品的氮含量。
式中：
Ｘ 为样品中的含氮量，ｇ/L；
Ｖ1为样品消耗盐酸的体积，ｍl ；
Ｖ0为空白消耗盐酸的体积，ｍl ；
Ｃ为盐酸标准溶液的浓度，mol/L ；
0.014为1 mol/L盐酸标准液1ml相当于氮的克数；
Ｖ样品为样品的取样体积，ml。
六、实验室中要注意的地方
1、若测表面活性剂原料，应先测一下原料的活性物含量，因为生产商给出的原料活性物浓度是一个范围，或是大于多少。
2、要保证搅拌时的温度，因为温度对zein溶解度有影响。
3、在搅拌时，尽量减少水分散失的百分比。
七、方法的应用范围
1、测试表面活性剂原料的刺激性，可以比较不同原料、相同原料不同厂家的刺激性。
2、测试不同表面活性剂互配的效果，看是否能减少刺激性，对表面活性剂互配给出数据依据。
3、可以测试表面活性剂为主体的产品的刺激性，比如洗发水、沐浴露等。因为消费者使用时，并不知道产品的表面活性剂浓度，只会按自己的习惯去使用，所以，用zein test对产品刺激性进行测试的话，建议统一稀释成10%的溶液，再进行后续的测试[8]。
八、方法的优点
1、相对快捷、简单、费用低。
2、厂家容易实现。
3、直接给出数据，避免了主观判定可能出现的误差。
九、方法的缺陷
1、只能应用在表面活性剂原料、表面活性剂为主体的产品刺激性的测试上，应用范围较窄。
十、讨论
表面活性剂原料原料中两个普遍存在的因素盐浓度和pH值会对测试结果产生一定的影响。
文献[11]报到pH7.4,离子强度0.1M的磷酸缓冲液会使zein在SDS溶液中的溶解度有所增加。文章的结论是离子强度对zein溶解不起主要作用。但按文献给出的图形，我估计至少10%的影响还是有的。假定表面活性剂中的盐均为NaCl,那么0.1M的离子强度对应0.1M的NaCl，即5.85g/L的NaCl。假定有一款原料活性物含量为30%，NaCl含量为10%。那么按照zein test进行测试，1%活性物的溶液，将含有0.333%的NaCl，即3.33g/L,相应的离子强度为0.057M，所以对测试结果还是有一定影响的。SDS是强刺激的表面活性剂，若换作一些相对温和的表面活性剂，相同的盐浓度，对测试的zein值是否会有更大的影响呢？
任婷婷等研究表明，在乙醇溶液中，随着pH增加，玉米醇溶蛋白的提取率逐渐增加，在pH为12时达到最大值，随后呈逐渐下降的趋势[20]。所以，据推测溶液的pH将会对测试的zein值有所影响，但不知会有多大的影响。
对于表面活性剂为主体的产品，比如洗发水、沐浴露，其成分相对表面活性剂而言复杂很多，那么潜在的干扰或影响zein test的因素也会增加。从前文，我们可以看到，zein具有疏水性和水不溶性，它不溶于较低浓度的盐溶液，但可溶于醇溶液、高浓度的尿素溶液、高浓度的碱溶液（pH＞11）、阴离子洗涤剂等，在60-95% 的乙醇溶液中可以维持其分子构象[18]。那么，我们目前常用的甘油、丙二醇、1，3丁二醇、1，2戊二醇、1，2己二醇等原料是否zein test测试值有影响？刘君对比异丙醇蛋白膜和没有加甘油蛋白膜可以了解到，甘油的添加降低了α螺旋、β转角和β折叠含量，增加了无规则卷曲的含量，甘油作为一种增塑剂，降低了蛋白分子间的键结合力，使蛋白分子间的结构变得松散，提高了蛋白膜的柔初性[21]。这一实验结果证明，甘油在有异丙醇存在时，是会对zein结构产生影响的。本人曾经做过表面活性剂和甘油共存时的zein test，实验表明，有甘油存在时，zein值会比无甘油存在时的理论预估zein值大，该实验需要进一步的验证。
上述的盐浓度、pH、溶剂（比如甘油）对zein值均可能存在影响，但影响有多大，需要更详细、明确的实验证据。上述因素是会影响zein值，存在3种可能：（1）因素本身造成zein值变化的；（2）因素与表面活性剂协同影响zein值；（3）前俩者兼而有之。
对于上述因素影响zein值变化的解释，也存在2种可能的解释：（1）因素对zein值的影响，是一种干扰作用；（2）因素对zein值的影响，是如实的表现了该因素会在表面活性剂存在的情况下，增加或减少对皮肤的刺激性。我个人可能更倾向于第（2）解释。
系统的、大规模的zein test数据暂时缺乏，其它测试刺激性的方法也存在相同的问题。期望zein test有更多的发表的文章和数据，同时其它测试刺激性的方法也有更多的发表的文章和数据。不同方法间能进行相关性的研究，为测试方法的优化、选择指明方向。
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